آنالیز HPLC چیست | دستگاه HPLC | کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

HPLC چیست ؟ آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ( High Performance Liquid Chromatography) یکی از روش های مهم در علم شیمی است که برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری مقادیر کم از مواد مورد استفاده قرار می گیرد. اولین بار روش های کروماتوگرافی (کروم به معنی رنگ و گراف به معنی ترسیم) توسط تسوت گیاه شناس روسی که بر روی جداسازی رنگدانه های برگ سبز کار می نمود، شناخته شد. به نتایج حاصل از دستگاه HPLC کروماتوگرام گفته می شود. در ادامه ی متن با این روش بیشتر آشنا خواهید شد.

کلمات پرکاربرد در روش های کروماتوگرافی:

*فاز متحرک (Mobile phase): گاز یا مایعی است که در سیستم جریان دارد و باعث جابجایی و حرکت نمونه در طول ستون می شود.

*فاز ساکن (Stationary phase): فاز جامد یا مایع سیستم کروماتوگرافی است که مواد بر روی آن جداسازی و یا جذب می شوند.

*زمان بازداری(Retention time): مدت زمان رسیدن نمونه به آشکار ساز را گویند.

*نمونه(Sample): ترکیبی است اغلب مایع که به جهت آنالیز و اندازه گیری به دستگاه تزریق می شود.

اساس جداسازی در آنالیز HPLC:

اساس جداسازی در روش های کروماتوکرافی تمایل نسبی هر جز به فاز ساکن به هنگام عبور فاز متحرک بر روی فاز ساکن است. به این صورت که گونه ای که تمایل بیشتری به فاز ساکن دارد با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می کند و گونه ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری از ستون عبور می کند.

شکل کلی دستگاه HPLC:

اجزا تشکیل دهنده دستگاه HPLC:

*پمپ:

پمپ از اصلی ترین قسمت های دستگاه HPLC است. به دلیل کم بودن قطر ذرات در ستون،افت فشار پدید می آید بنابراین باید از پمپ که موجب می شود نمونه با فشار (حدود 40 مگاپاسکال) وارد سیستم شود، استفاده نمود. پمپ ها انواع مختلفی دارند که در HPLC بیشتر از نوع پیستونی استفاده می شود. مهمترین ویژگی پمپ ها، جریان یکنواخت و بدون پالس می باشد که دمپرها این کار را انجام می دهند.نکته قابل ملاظه در پمپ ها، استفاده از قطعات ضد خوردگی می باشد که سبب تزریق مایعات و حلال های خورنده به سیستم می شوند.

*دگازر:

قبل از ورود حلال به دستگاه باید از نبود هوا یا دیگر گازها در آن اطمینان حاصل نمود زیرا وجود هوا موجب بروز پیک های اضافی و تداخل با پیک های حاصل از نمونه می گردد. Degasser یا گاززدا در HPLC ، حذف هوا و یا گازهای اضافی را برعهده دارد و از ورود آنها به سیستم جلوگیری می کند.

*سیستم تزریق:

بالا بودن فشار در سیستم به دلیل حضور پمپ ها، امکان تزریق مستقیم به دستگاه را غیر ممکن می سازد. سیستم تزریق شامل یک لوپ (حلقه نمونه بردار) است و دارای بارگیری(Load) و تزریق (Inject) می باشد.هنگام تزریق، انژکتور را بر روی لود قرار داده سپس بر روی تزریق گذاشته تا نمونه تزریقی به سمت ستون حرکت کند. مقدار تزریق در HPLC کمتر از GC است و در حدود 5 تا 500 ماکرولیتر است.

*ستون:

به این دلیل که جداسازی اجزای نمونه به هنگام عبوردر داخل ستون صورت میگیرد، ستون ها از مهمترین بخش های دستگاه HPLC می باشند وبه طور کل به چند دسته تقسیم می شوند که در زیر به اختصار به توضیح آن ها می پردازیم:

**ستون های کروماتوگرافی فاز نرمال(Normal Phase) :

در این نوع ستون ها ، برهم کنش بین بخشهای قطبی فاز ساکن و جسم حل شده وجود دارد. ترکیب فاز ساکن باید به نسبت فاز متحرک قطبی تر باشد.

**ستون های کروماتوگرافی فاز معکوس (Reversed Phase):

در این نوع ستون های HPLC  ماده ی موجود در ستون نسبتا غیر قطبی و حلال با توجه به نمونه، قطبی است. برهمکنش بین ترکیبات غیر قطبی جسم های حل شده و فاز ساکن غیر قطبی رخ می دهد. این ستون ها در مقایسه با ستون های فاز نرمال زیست سازگارتر است.

**ستون ها کروماتوگرافی تعویض یونی:

در این نوع ستون ها که دارای دو نوع کاتیونی (Cation Exchange) و آنیونی (Anion Exchange) می باشند، ترکیبات نمونه براساس نیرو های یونی بین مولکول های با بار مخالف نسبت به بارهای موجود در فاز ساکن ، جدا می شوند.

**ستون های کروماتوگرافی اندازه طردی (طرد غربالی، Size Exclusion):

در این ستون ها ، مولکول ها براساس اندازه جدا می گردند. مولکول های کوچک به درون حفره های صافی نفوذ می کنند در حالی که مولکول های بزرگتر تنها به اندازه ای به درون آن ها نفوذ می کنند.

*آشکارساز:

انتخاب یک آشکارساز مناسب منجر به بهبود انتخاب پذیری و حساسیت فاز ساکن می گردد. در زیر به تعدادی از آشکار سازهای مورد استفاده در HPLC می پردازیم:

انواع آشکارسازها:

• آشکارسازهای UV-VIS و PDA:

از رایج ترین آشکارسازهای HPLC، که جز آشکارسازهای جذبی هستند و حساسیت خوبی برای ترکیبات جاذب نور دارند. در هنگام آنالیز، نمونه وارد یک سل شیشه ای بی رنگ ، به نام Flow cell می شود. هنگامی که نور UV بر سل جریان تابش می شود، نمونه بخشی از نور UV را جذب می کند.شدت نور UV برای فاز متحرک بدون نمونه (شاهد) و حاوی نمونه متفاوت خواهد بود. با اندازه گیری این تفاوت، مقدار نمونه تعیین می شود. از آنجا که این دتکتور با استفاده از قانون بیر لامبرت کار می کند لازم است که برای هر آنالیت طول موج مناسب را انتخاب نمود. یک دتکتور UV در طول موج بین 195 تا 370 نانومتر را اندازه گیری می کند که بیشترین استفاده در 254 نانومتر است. در مقایسه با یک آشکارساز UV، آشکارساز VIS گستره بیشتری (400 تا 700 نانومتر) دارد.

آشکار سازهای فتودیود آرای توانایی جمع آوری همزمان چندین طول موج در یک آنالیز و همچنین مقایسه داده های طیفی ترکیبات  باهم را دارند. آشکارسازهای UV و VIS نتایج به دست آمده را در دو بعد شدت نور و زمان نشان می دهند اما PDA بعد سوم یعنی طول موج را نیزاضافه می کند.

• آشکارساز Reflactive Index

 آشکارساز RI تغییر در شاخص رفلکس را اندازه گیری می کند. سل شیشه ای به دو سل تقسیم می شود. خروجی از ستون وارد سل نمونه شده و سل دیگر(سل مرجع) تنها با فاز متحرک پر شده است. هنگامی که جریان خروجی وارد سل نمونه که حاوی هیچ آنالیتی نیست می شود، حلال در داخل هر دو سلول یکسان است (A). هنگامی که یک پرتو بر روی سل ها تابیده می شود، پرتو مشاهده شده در این مورد مستقیم خواهد بود.زمانی که خروجی ستون دستگاه HPLC حاوی ترکیب دیگری به غیر از فاز متحرک باشد پرتو ورودی به دلیل اختلاف شاخص رفلکس بین دو حلال خم می شود(B). با اندازه گیری این تغییر، حضور اجزا مشاهده می گردد.

به طور کلی از این آشکارساز برای ترکیباتی نظیر شکر،الکل ها،یون های معدنی و هیدروکربن ها که در UV جذب ندارد استفاده می شود و حساسیت آن نسبت به UV کمتر است.

• دتکتور ELSD) Evaporative Light Scattering Detector):

آشکار ساز پراکندگی نور حساسیت خوبی برای آنالیت های غیرفرار در مقیاس نانوگرم (ng) دارد.به طور کلی این دتکتور، برای ترکیباتی که فراریت کمتری نسبت به فاز متحرک دارند و همچنین ترکیباتی که قادر به جذب نور UV نیستند مانند قندها، آنتی بیوتیک ها، اسیدهای چرب، چربی ها، روغن ها، فسفولیپید ها، پلیمرها و تری گلیسیریدها استفاده می شود. طریقه عملکرد این دتکتور به این صورت است که خروجی ستون HPLC اسپری شده و سپس فاز متحرک تبخیر می گردد تا ذرات ریزی را ایجاد کند، سپس نور لیزر به آنالیت تابیده می شود و بازتابش پراکنده شده آن توسط دتکتور تشخیص داده می شود. عملکرد ELSD تقریبا مشابه  RI است اما نسبت به آن حساس تر است.

• دتکتورهای الکتروشیمیایی (EC):

بر اساس اندازه گیری جریان حاصل از واکنش اکسیداسیون/احیای آنالیت در الکترود مناسب استوار است و تشخیص برر اساس روش های الکتروشیمیایی نظیر پلاروگرافی،کولومتری،آمپرومتری و هدایت سنجی می باشد.

• آشکارساز MALS (Multi-Angle Light Scattering Detector)

در آنالیز (Size exclusion chromatography (SEC یا غربالگری، جرم ملکولی آنالیت از روی نمودار کالیبراسیون و با استفاده از محلول استاندارد تعیین می شود. در حالی که با استفاده از دتکتور پخش نور چند زاویه ای، جرم ملکولی به طور مستقیم و بدون نیاز به منحنی کالیبراسیون تعیین می گردد. علاوه بر آن با استفاده از دتکتور MALS در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا می توان جرم ملکولی مطلق آنالیت را با حد تشخیص بسیار پایین تعیین کرد.

• آشکارساز طیف سنجی جرمی (Mass Spectroscopy)

بر اساس وزن مولکولی آنالیت شناسایی می شوند.به طور کلی برای ترکیبات پایدار حرارتی،قطبی و با وزن مولکولی بالا استفاده می گردند.

• آشکارساز هدایت الکتریکی (Conductivity Detector):

دتکتور CD در کروماتوگرافی یونی استفاده می شود و برای محلول های حاوی اجزای یونی کاربرد دارد.مقاومت الکترونیکی توسط دتکتور اندازه گیری می شود که این عدد متناسب با غلظت یون های موجود در محلول است.

• آشکارساز چرخش نوری (Optical Rotation Detector):

دتکتور OR برای اندازه گیری ترکیبات دارای ایزومر نوری استفاده می شود و قادر به جداسازی ایزومرهای نوری R  وL می باشد.

• آشکارساز رزونانس مغناطیس هسته:

اتصال روش های جداسازی کروماتوگرافی با NMR منجر به ایجاد روشی قدرتمند و سریع برای جداسازی و تبیین ساختاری ترکیبات مجهول و مخلوطها شده است.حساسیت پایین این روش با مزایای فراوانی که در پی دارد جبران می شود.

• آشکارساز (Fluorescence Detector ( FL:

در دتکتورهای فلورسانس با استفاده از یک طول موج خاص، اتم های آنالیت برانگیخته شده و از خود یک نور تک پرتویی منتشر می کنند. شدت نور فلورسانس منتشر شده برای اندازه گیری غلظت آنالیت بکار برده می شود. بسیاری از داروها، محصولات طبیعی، نمونه های پزشکی و محصولات پتروشیمی دارای جذب فلورسانس می باشند. برای سایر مواد که جذب فلورسانس ندارند یا جذب پایینی دارند می توان از مشتقات فلورسانس مانند دانسیل کلرید استفاده کرد.

• آشکارساز (Chemiluminescence Detector (CLD:

دتکتور نورتابی شیمیایی مشابه FL می باشد اما به جای استفاده از منبع نور برای برانگیخته کردن اتم ها، برانگیختگی در ابتدا توسط واکنش شیمیایی انجام می شود. از آنجا که استفاده از دتکتور CLD بر روی دستگاه HPLC وابسته به منبع برانگیختگی خارجی نیست، نویز دتکتور بسیار کم است که باعث افزایش حساسیت و دقت آن نسبت به دتکتور FL می گردد.

انواع سیستم شویش:

• شویش ایزوکراتیک یا تک حلالی: در این سیستم ترکیب حلال در کل زمان شویش ثابت باقی می ماند. استفاده از این نوع سیستم حلال موجب افزایش زمان شویش شده و قدرت جداسازی گونه هایی با قطبیت مشابه را ندارند.
• شویش گرادیانی،شیبی یا چند حلالی : در این شویش از دو یا چند حلال با قطبیت مختلف استفاده می شود که نسبت آنهاطبق برنامه زمانی تعیین شده تغییر می کند. در این روش قدرت شویش و جداسازی بالا رفته و در مخلوطهای پیچیده که اجزاء دارای گستره ی وسیعی از قطبیت هستند، امکان جداسازی بهتری را فراهم می کند. کوتاه شدن  زمان جداسازی از دیگر مزایای این سیستم شویش است.

منابع:

*Snyder, Lloyd R., Joseph J. Kirkland, and Joseph L. Glajch. Practical HPLC method development. John Wiley & Sons, 2012.

*Ahuja, Satinder, and Michael Dong, eds. Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC. Vol. 6. Elsevier, 2005.

*Smith, Ivor, ed. Chromatography. Elsevier, 2013.

*Snyder, Lloyd R., Joseph J. Kirkland, and John W. Dolan. Introduction to modern liquid chromatography. John Wiley & Sons, 2011.

*Neue, Uwe D., and M. Zoubair El Fallah. HPLC columns: theory, technology, and practice. Vol. 1. New York: Wiley-VcH, 1997.

*https://www.shodex.com/en/kouza/f.html

خرید و فروش موادشیمیایی ر ا به ما در مبتکران شیمی بسپارید